活性氧檢測試劑盒的使用說明
活性氧包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFHDA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。故而檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。活性氧檢測試劑盒的使用如下：
（1）裝載探針：對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
（2）原位裝載探針
（3）收集細胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μM。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬1×106～2×107/mL，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。
（4）加藥刺激：直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。
（5）檢測：對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。
